21日龄断奶对仔猪肠道形态肠道通透性及

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导读

我国传统的仔猪断奶时间为56日龄左右，而现代生猪养殖为了追求生产效率，仔猪早期断奶已成为规模化猪场的普遍生产方式，一般在21～35日龄时断奶。然而，35日龄前仔猪消化道发育尚未健全，饲粮由液体母乳转为适口性较差的固体饲粮，使肠道内环境受到很大冲击。断奶伴随着转群运输、新猪舍环境适应、仔猪混养等，使仔猪发生断奶应激，引起采食量下降、消化不良、腹泻和生长缓慢等一系列“仔猪早期断奶综合征”。因此，选择合适的断奶时间，平衡母猪流转效率和仔猪健康，对于猪场的综合效益尤为重要。

肠道不仅是动物吸收营养的主要场所，也是体内重要的免疫器官。断奶应激严重损伤仔猪肠道形态和功能，导致肠黏膜屏障受损，引起肠道形态发生变化、肠道通透性增加，极大地影响其未来的生产性能和免疫功能。基于肠道功能发育规律是选择和优化仔猪断奶时间的关键基础。目前研究多集中在不同断奶日龄（14～35日龄）对仔猪生长性能、消化器官和酶活性的影响，但有关断奶后仔猪肠道形态和功能发育规律的研究较少。本试验旨在研究21～28日龄仔猪肠道结构、紧密连接蛋白和细胞因子的发育性变化以及21日龄断奶对仔猪肠道形态和功能的损伤，为合理选择早期断奶时间、制订预防断奶应激损伤策略提供新思路。

1.1试验设计与试验

饲粮采用2×3双因子完全随机试验设计，组别（哺乳组、断奶组）和日龄（22、24和28日龄）为2个主效应。选取6窝体况相近的健康大白仔猪，每窝为10~12头。21日龄时，每窝选取6头平均体重为（6.1±0.2）kg的仔猪，随机分为2组，分别为断奶组（于保育舍饲喂基础饲粮）和哺乳组（于原产床继续哺食母乳）。断奶仔猪单栏饲养，舍内温度和光照时间与哺乳仔猪保持一致，温度维持在30℃左右；自由饮水，采用湿拌料方式饲喂，每天08：00和16：00饲喂玉米-豆粕型基础饲粮。基础饲粮参照NRC（）营养标准配制成粉料，营养成分满足5~10kg仔猪的营养需要量，其组成及营养水平见表1。

1.2样品采集

分别于22、24和28日龄时，仔猪禁食12h后，进行前腔静脉采血，肝素抗凝，静置1h，r/min离心后制备血浆，-80℃保存。按照窝源一致的原则，每窝选取2头（哺乳组和断奶组各1头，即每组6头仔猪），放血处死后，剖开腹腔分离出空肠和回肠，采集空肠前端和回肠末端肠道，使用预冷的生理盐水轻轻冲洗后，手术刀刮取黏膜，分装于2mL冻存管，液氮速冻后转移至-80℃保存；剪取约1cm的空肠和回肠肠环，浸入4％多聚甲醛固定。

1.3测定指标与方法

1.3.1生长性能

分别于22和28日龄时对仔猪称重，计算仔猪断奶后的平均日增重（按照生长至28日龄的12头仔猪计算）。每天观察仔猪的健康和腹泻情况，计算腹泻率。

腹泻率（％）＝［试验期内仔猪腹泻头数/（试验天数×同组仔猪头数）]×。

1.3.2肠道形态

将固定好的空肠和回肠肠环组织石蜡包埋后切片（3~4μm），采用苏木精-伊红（HE）染色，中性树脂封片，光学显微镜下观察。LeicaLAX软件拍照并对空肠、回肠的绒毛高度和隐窝深度作定量分析。

1.3.3血浆和肠道黏膜的二胺氧化酶（DAO）活性

肠道黏膜组织进行10％组织匀浆。血浆和肠道黏膜组织液的DAO活性采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定。

1.3.4肠道黏膜相关基因表达

空肠和回肠黏膜总RNA的提取采用试剂盒（QIAGEN），并用微量分光光度计（Bio-Drop）测定总RNA的纯度和浓度。按照试剂盒（PrimeScript?RTReagentKitwithgDNAEraser，TaKaRa）操作步骤反转录合成cDNA。反应体系按照SYBR?PremixExTaq?试剂盒说明书配制。荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性10s；60℃退火延伸30s，共40个循环；熔解曲线的制作参照荧光定量PCR仪（Bio-RadCFX96）操作说明书进行。基因的mRNA表达量采用2-ΔΔCt方法计算，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参基因，引物见表2，由英潍捷基贸易有限公司合成。

1.4数据统计

采用JMP10.0软件分析数据，生长性能采用t检验统计分析，其余指标采用2×3双因子统计分析，Tukey法进行多重比较。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2.日龄断奶对仔猪生长性能的影响

由表3可知，2组仔猪的初重（断奶时体重）无显著差异（P＞0.05）。与哺乳组相比，28日龄（断奶后第7天）时，断奶组仔猪的末重和平均日增重均极显著降低（P＜0.01）。断奶组仔猪断奶后第1~3天的腹泻率高于哺乳组，但无显著差异（P＞0.05）。

2.日龄断奶对仔猪肠道组织形态的影响

由图1可知，断奶组仔猪的空肠绒毛脱落、隐窝凹陷。由表4可知，断奶组仔猪的空肠绒毛高度极显著低于哺乳组（P＜0.01）。组别和日龄对空肠隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度有极显著交互作用（P＜0.01），断奶组的空肠隐窝深度极显著高于哺乳组（P＜0.01），哺乳组的空肠隐窝深度随着日龄的增加逐渐降低，而断奶组则逐渐增加；22日龄时，断奶组的空肠隐窝深度与哺乳组相比无显著差异（P＞0.05）；24和28日龄时，断奶组的空肠隐窝深度极显著高于哺乳组（P＜0.01）。断奶组的空肠绒毛高度/隐窝深度极显著低于哺乳组（P＜0.01），哺乳组28日龄时的空肠绒毛高度/隐窝深度极显著高于22和24日龄时（P＜0.01），而断奶组在不同日龄时无显著差异（P＞0.05）。

由图2可知仔猪回肠形态的变化。由表5可知，与空肠不同，组别和日龄对仔猪的回肠绒毛高度有极显著交互作用（P＜0.01），哺乳组的回肠绒毛高度极显著高于断奶组（P＜0.01），哺乳组24日龄时的回肠绒毛高度极显著高于22日龄时（P＜0.01），而断奶组在不同日龄时无显著差异（P＞0.05）。断奶组的回肠隐窝深度极显著高于哺乳组（P＜0.01），回肠隐窝深度随着日龄的增加逐渐增加（P＜0.05）。断奶组的回肠绒毛高度/隐窝深度极显著低于哺乳组（P＜0.01），2组的回肠绒毛高度/隐窝深度在不同日龄时均无显著差异（P＞0.05）。

2.日龄断奶对仔猪血浆和肠道黏膜DAO活性的影响

由表6可知，组别和日龄对仔猪的空肠黏膜DAO活性有显著交互作用（P＜0.05），断奶组的空肠黏膜DAO活性极显著低于哺乳组（P＜0.01）。2组的血浆DAO活性在不同日龄时无显著差异（P＞0.05）。断奶组的回肠黏膜DAO活性显著低于哺乳组（P＜0.05），但2组的回肠黏膜DAO活性在不同日龄时无显著差异（P＞0.05）。

2.日龄断奶对仔猪肠道黏膜紧密连接蛋白mRNA表达量的影响

由图3可知，组别和日龄对仔猪空肠黏膜闭锁蛋白（occludin）的mRNA表达量有极显著交互作用（P＜0.01），哺乳组空肠黏膜occludin的mRNA表达量随着日龄的增加先升高后降低（P＜0.05），断奶组在不同日龄时无显著差异（P＞0.05）；与哺乳组相比，断奶组22日龄时空肠黏膜occludiｎ的mRNA表达量有下降趋势（P＝0.05），24日龄时显著降低（P＜0.05）。空肠黏膜闭锁小带蛋白1（ZO-1）的mRNA表达量随着日龄的增加先升高后降低（P＜0.05）。断奶组回肠黏膜ZO-1和occludin的mRNA表达量显著低于哺乳组（P＜0.05），24日龄时回肠黏膜ZO-1的mRNA表达量显著高于22日龄时（P＜0.05）。

2.日龄断奶对仔猪肠道黏膜细胞因子mRNA表达量的影响

由图4可知，组别和日龄对仔猪空肠黏膜肿瘤坏死因子α（TNF-α）的mRNA表达量有显著交互作用（P＜0.05），断奶组24和28日龄时空肠黏膜TNF-α的mRNA表达量显著高于哺乳组（P＜0.05）。断奶组空肠黏膜白细胞介素10（IL-10）的mRNA表达量显著低于哺乳组（P＜0.05）。日龄对空肠黏膜细胞因子的mRNA表达量无显著影响（P＞0.05）。

由图5可知，与空肠黏膜不同，组别和日龄对仔猪回肠黏膜细胞因子的mRNA表达量无显著交互作用（P＞0.05）。回肠黏膜白细胞介素1β（IL-1β）的mRNA表达量随着日龄的增加而降低（P＜0.05）。2组回肠黏膜细胞因子的mRNA表达量无显著差异（P＞0.05）。

仔猪消化道发育尚未健全，肠道免疫功能低下，微生物区系不稳定，断奶时会遭遇环境、营养、心理等多方面的挑战，造成仔猪断奶后生理机能紊乱。研究表明，肠道疾病往往随着断奶应激而出现，这表明断奶应激在疾病感染中起到至关重要的作用。本试验中，21日龄断奶诱发了仔猪应激，表现为体重显著下降，平均日增重降低了86.46％，断奶后第1天有16.67％存在腹泻情况，生长性能受到严重影响。肠道是断奶应激的主要损伤部位之一。空肠和回肠是小肠中营养物质吸收的重要肠段，其绒毛形态和功能发育是否良好，直接影响机体对营养物质的吸收。本试验中，仔猪断奶后空肠和回肠绒毛变短，并伴有脱落现象，同时隐窝凹陷，说明21日龄断奶严重影响了仔猪肠道的形态和发育。断奶后绒毛变短，减少了肠道吸收面积，是引起仔猪平均日增重极显著降低的重要原因之一。

肠道绒毛作为机体营养物质吸收的主要部位，小肠绒毛上皮细胞将消化道中的氨基酸、葡萄糖、无机盐等吸收进入血液，若此部位受损，会影响营养物质的吸收。DAO主要存在于哺乳动物肠道黏膜或绒毛上皮细胞中，是组胺等多胺物质进行代谢的重要调节酶，并在细胞增殖中发挥重要作用，肠道黏膜DAO活性与肠道黏膜绒毛高度、肠上皮细胞的完整性和成熟度有密切关系。本试验结果表明，哺乳组仔猪的空肠黏膜DAO活性随着日龄的增加逐渐降低，断奶组却无显著变化，这表明哺乳期仔猪肠道处于不断发育的过程中，上皮细胞不断发生增殖分化，28日龄时空肠黏膜DAO活性降低说明仔猪肠道上皮细胞发育趋于稳定。而断奶组的仔猪回肠黏膜DAO活性显著低于哺乳组，说明21日龄断奶严重损坏仔猪肠道上皮细胞的完整性和成熟度，造成仔猪肠道绒毛变短。

肠道黏膜中肠上皮细胞、黏蛋白、肠道黏膜相关淋巴组织及其分泌的细胞因子、抗菌肽、微生物区系等形成了天然的屏障，维护肠道和机体健康。肠上皮细胞通过紧密连接等细胞连接形成机械屏障，外周血中DAO活性是肠上皮细胞机械屏障损伤的重要标志。正常生理条件下血浆DAO活性较低，当肠道黏膜受损时，DAO可以由肠黏膜进入血液循环导致血浆中DAO活性增加。本试验中，断奶后血浆DAO活性提高了10.67％，但由于动物个体差异大，未达到显著水平。断奶后回肠黏膜ZO-1、occludin的mRNA表达量显著降低，24日龄时空肠和回肠黏膜ZO-1的mRNA表达量显著高于22日龄时，这表明21日龄断奶，肠上皮细胞间紧密连接的结构蛋白表达在转录水平受到抑制，破坏了肠黏膜屏障，增加了肠道通透性。栾兆双研究发现，仔猪断奶后紧密连接蛋白ZO-1、occludin的mRNA表达量显著降低，28日龄后逐渐升高；Weiler等研究发现，在应激条件下，ZO-1、occludin的mRNA相对表达量降低，与本研究结果基本一致。28日龄时断奶仔猪空肠occludin的mRNA表达量基本达到哺乳仔猪水平，说明断奶7d后，肠道黏膜损伤基本得到修复。

得益于肠上皮细胞形成的机械屏障，水、离子等可溶性小分子物质可以选择性地通过，而毒素、病原体等有害物质被阻止进入。由于21日龄断奶造成了肠道屏障损伤，毒素、病原体等有害物质进入，可能激活肠黏膜中固有层淋巴组织、派伊氏结（PP结）、肠系膜淋巴结，产生免疫应答，分泌细胞因子。本试验研究发现，断奶组24和28日龄时空肠黏膜TNF-α的mRNA表达量显著高于哺乳组，而空肠黏膜IL-10的mRNA表达量显著低于哺乳组。Pié等研究也发现，仔猪断奶后肠道促炎性细胞因子IL-1β、白细胞介素6（IL-6）和TNF-α的mRNA表达量迅速升高，肠道出现炎症反应。研究表明，肠黏膜的树突状细胞在黏膜中不断捕获由杯状细胞转运的抗原，分泌IL-10和转化生长因子β（TGF-β）并迁移至肠系膜集合淋巴结，活化初始T细胞为Treg，在免疫耐受中发挥至关重要的作用。在人和小鼠中敲除抗炎性因子IL-10或其受体后会表现强烈的炎症反应，还使促炎性因子的分泌增加。与空肠黏膜相比，断奶并未引起回肠黏膜细胞因子mRNA表达量的显著变化，表明在断奶应激条件下仔猪回肠的免疫稳定能力优于空肠，推测与回肠上富有黏膜相关淋巴组织相关。PP结作为黏膜淋巴相关组织的重要组成部分，主要集中在回肠，它是一个完整的执行免疫应答的功能场所，聚集着执行适应性免疫的CD+4T细胞、CD+8T细胞、B细胞和巨噬细胞等，当肠道中的抗原被传递到黏膜相关淋巴组织后，会激活B细胞引起体液免疫应答，同时也可被树突状细胞捕获后活化T细胞，引起更强烈的免疫应答。本试验中回肠黏膜免疫屏障表现出的强耐受力可能与此机制相关。

断奶时间的选择不仅要考虑母猪的流转，还要考虑仔猪的成活率。目前猪场常采用21或28日龄断奶。21~28日龄是仔猪快速发育阶段，断奶的窗口期应基于仔猪发育的生理状况来确定。本研究结果表明，21~28日龄时，哺乳仔猪肠道绒毛持续发育，表现为绒毛高度逐渐增长；肠道屏障功能在24日龄时最高，表现为肠上皮细胞间的紧密连接蛋白的mRNA表达量最高，肠黏膜促炎性因子TNF-α的mRNA表达量在24日龄时下降。综合这些指标，24日龄是仔猪肠道发育的关键点。21日龄断奶后，仔猪生长至24日龄时肠道绒毛损伤最为严重，表现为肠道绒毛最短且脱落现象最严重、血浆DAO活性最高、肠道紧密连接蛋白的mRNA表达量严重下降、促炎性因子的mRNA表达量上升。由此可知，24日龄是断奶应激损伤最严重的时间点。在这个时间节点的严重应激损伤一方面是因为应激反应发展的进程，另一方面是因为仔猪肠道发育在24日龄前后的变化显著。尽管21日龄断奶后至28日龄，仔猪肠道形态、屏障功能均有所恢复，但推荐在24日龄时仔猪完成消化道发育进程后断奶。本研究还发现了断奶影响肠道屏障功能的重要黏膜细胞因子。关于饲料添加剂改善仔猪生长性能、维持肠道健康已有许多报道。因此，在选择合理的断奶时间的同时，配合新型饲料添加剂促进抗炎性细胞因子的表达、加强肠道屏障功能，将有助于仔猪更好地度过断奶应激。

①哺乳仔猪22~28日龄肠道发育趋于成熟。

②21日龄断奶会破坏仔猪肠道上皮细胞的结构，肠道绒毛变短和脱落，影响营养物质吸收，造成仔猪腹泻，降低平均日增重。

③21日龄断奶抑制肠道紧密连接蛋白mRNA的表达，损伤屏障功能，导致肠道通透性增加，引起肠道炎症反应。

④24日龄是仔猪肠道发育的关键时间点，以24日龄后断奶为宜。

注：本文由生物饲料开发国家工程研究中心（BFC）小编整理发布，如有任何建议或意见及投稿等，请您加小编