母乳糖复合物对新生儿肠道菌群的影响

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1母乳中的生物活性分子

母乳中含有大量的营养素和生物活性分子,结构非常复杂，包括激素、生长因子、抗生素、低聚糖、免疫球蛋白、粘蛋白、糖脂及其代谢物。母乳的成分在泌乳期内不同的喂养阶段保持着动态平衡。在哺乳期母乳成分的显著变化反映了婴儿的需求,初乳中含有大量的生物活性物质,其中含有高浓度的乳蛋白，比如免疫球蛋白和抗菌物质。母乳作为婴儿的营养素和免疫力的唯一来源，支持着新生儿发育。乳糖和脂类是婴儿的主要营养源。人乳寡糖是具有多种生物学功能的游离聚糖。据估计，母乳中超过70%的蛋白质都是糖基化的，含有N-linked和O-linked多糖。人乳寡糖连同许多糖蛋白和糖脂组成了母乳中的糖复合物。

1.1人乳寡糖（HumanMilkOligosaccharides，HMO）人乳寡糖是母乳中仅次于乳糖和乳脂的第三大固体成分。HMOs结构复杂，由3~14种单糖组成。D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、L-岩藻糖和N-乙酰神经氨酸（唾液酸）是HMOs的结构基础。以乳糖[Gal(β1-4)Glc]为基本核心，重复扩展N-乙酰半乳糖胺，可以分为I型[乳糖(β1-3)GlcNAc]或II型[乳糖(β1-4)GlcNAc]。此外HMOs主要在末端位置修饰岩藻糖或N-乙酰神经氨酸。岩藻糖基化修饰主要在还原端以Fuc(α1-3)形式存在，在非还原端以Fuc(α1-2)形式存在。

HMOs是由几个糖基转移酶在乳腺中合成。α1-2、α1-3和α1-4岩藻糖基化的寡糖核心结构的产生依赖于H血型基因、Lewis抗原和分泌状态。由FUT2修饰的α1,2岩藻糖转移酶编码定义分泌状态，在体液中（包括母乳）分泌型的个体产生ABH抗原。Lewis血型基因FUT3编码α1,3/4岩藻糖转移酶形成α1,4岩藻糖基化，形成分泌型LewisB抗原和非分泌型LewisA抗原。FUT2和FUT3基因是独立的，能产生结合表型。70%的人表达FUT2和FUT3。此外,唾液酸通过α2,3、α2,6糖苷键形成唾液酸乳糖。体外[6]和体内观察[4]中发现HMOs在胃肠道中不能被吸收。HMO研究的最大挑战之一是个体之间的变化，特别是每个HMO由多个异构形式组成,产生各种可能的结构形式。最近，有研究人员采用HPLC-（TOF）的方法鉴定了中性和唾液酸化的HMO，这一方法有助于HMO结构与功能的研究。

1.2糖蛋白乳铁蛋白是母乳中的多功能蛋白，具有抗菌性、铁螯合、抗炎性和益生元的功能。人乳铁蛋白是分子量为80kDa的糖蛋白，在母乳中含量丰富，在初乳中浓度为7g/L，在成熟乳中为2g/L。人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白可释放出强效的杀菌肽——乳铁蛋白肽，与革兰阴性细菌（如大肠埃希菌和沙门菌）的细胞壁成分脂多糖相结合从而达到抑菌效果。人乳铁蛋白是高度糖基化的蛋白，乳铁蛋白糖基化能保护蛋白质免受肠道中的蛋白酶水解。甚至在母乳喂养儿粪便中发现完整的乳铁蛋白，表明这种蛋白质对胃肠道酶活性具有抵抗力，在进入肠道后被微生物代谢、吸收，因此对于肠道微生物有着重要影响。

酪蛋白糖巨肽是κ-酪蛋白的c末端蛋白(氨基酸-)。已知的糖巨肽存在两个基因变异型，变异型A和变异型B，它们具有两个不同的蛋白质的氨基酸序列。分子量为8kDa。然而，由于糖基化、二聚体、三聚体的形成，其实际大小可以高达30kDa。牛乳中糖巨肽的糖链可能包含五个不同O-linked寡糖链，这些大部分都是水杨酸化的。糖巨肽也是胃肠道功能的一个重要的生物调节剂，能刺激人和动物体内胰酶分泌素的释放[12]。

1.3糖脂母乳跟牛乳中的鞘糖脂大多是神经节苷脂，在它们的多糖链中含有唾液酸残基。神经节苷脂由神经酰胺脂链与酸性寡糖链结合，神经酰胺部分嵌入乳脂肪球的膜中，而糖基暴露在表面，类似于上皮细胞膜神经节苷脂的构象。人初乳中主要神经节苷脂是GD3（Siaα2-8、Siaα2-3、Galβ1-4、Glcβ1-1、神经酰胺），包含65%糖脂，而在成熟乳中GM3（Siaα2-3、Galβ1-4、Glcβ1-1、神经酰胺）是主导，占糖脂的70%。神经节苷脂的化学性质使它们很难纯化和分析。目前，使用高效液相质谱法分析牛乳中的神经节苷脂的最新研究主要集中在定量检测哺乳期牛奶中神经节苷脂的特定含量方面。这项研究显示在哺乳期第2天母乳中存在大量的神经节苷脂（GM3，0.98mg/L；GD3，15.2mg/L），在随后2周快速减少（GM3，0.15mg/L；GD3，3.3mg/L），3个月时逐渐稳定（GM3，0.15mg/L；GD3，2.4mg/L）。

2新生儿和婴儿肠道菌群的发育

出生后肠道微生物菌群的定植是形成人体肠道菌群的一个主要因素。早期肠道菌群的定植对人体的生理功能有重要影响。因此，研究肠道菌群在新生儿发育过程中的变化至关重要。新生儿肠道菌群研究特别适用于早产儿的预防。新生儿的肠道微生态系统由肠黏膜、肠腔内的营养物质和微生物群组成，是非常复杂并受严格控制的。在子宫里，胎儿的肠道是半无菌的状态，与新生儿肠道完全不同。出生后不久，与新生儿肠道共生的细菌逐步增加。几个因素影响早期婴儿肠道菌群，包括分娩方式(顺产或剖腹产)、出生时妊娠周期(早产或足月)、早期使用抗生素和喂养方式(母乳或配方)等。婴儿的肠道微生物菌群的构成在出生后会发生连续变化，波动性较大。母亲的肠道微生物可能是婴儿肠道微生物的主要来源。通过母亲产生第一批微生物群，因此，分娩方式对新生儿菌群影响较大。顺产的新生儿双歧杆菌和乳杆菌占大比例。剖腹产的新生儿双歧杆菌含量较低而梭状芽胞杆菌则显著高于前者。但是，母乳喂养的剖腹产婴儿其肠道中双歧杆菌的水平也较高，这说明了母乳喂养的重要性。出生的最初几天，肠道由不同种类的微生物组成，在1周后逐渐稳定。在最初的菌群中，大肠埃希菌、粪肠球菌和肠球菌占主要地位。随后，兼性厌氧菌逐渐耗氧气，造成厌氧环境使专性厌氧菌开始增长，这些专性厌氧菌主要包括双歧杆菌、拟杆菌、梭状芽胞杆菌，其次是韦荣球菌属、瘤胃球菌属、真细菌等。这些细菌的定植是肠道发育和免疫系统成熟的必要条件。

2.1母乳喂养儿的肠道菌群作为新生儿唯一的营养来源，母乳会刺激肠道反应同时提供足够的能量来维持正常发育和胃肠道内稳态。新一代高通量测序技术的发展使我们对肠道微生物群落在肠道发育过程中的作用有了更好的认识，婴儿肠道内双歧杆菌的优势已经被多项研究证实。婴儿肠道菌群的分析表明母乳会建立一个高度适应的肠道菌群，由双歧杆菌或者母乳型微生物群（MOM）主导。长双歧杆菌、短双歧杆菌是寄居在婴儿胃肠道的最常见菌。这一趋势与母乳喂养一致，不受地域或者母亲年龄的影响。

2.2人工喂养儿的肠道菌群双歧杆菌在婴儿肠道微生物菌群中占主导地位，达到肠道微生物菌群的75%。事实上，双歧杆菌属在母乳喂养和奶粉喂养的婴儿中都存在，只是菌种不同。B.longum、B.infantis、B.breve和B.bifidum一般在母乳喂养的婴儿中被发现，在人工喂养的婴儿肠道中有青春双歧杆菌和假链状双歧杆菌，这些菌也常见于成人肠道中。Yatsunenko等报道过母乳喂养的婴儿中有大量的双歧杆菌、欧文氏菌、放线菌和嗜血杆菌，然而人工喂养的婴儿中双歧杆菌很少，但是有更多的厚壁菌门细菌和拟杆菌门细菌。

2.3早产儿缺乏母乳型微生物群32周之前出生的婴儿属于早产儿。母乳可以给足月的婴儿提供营养和保护，但是在很多方面无法满足早产儿的发育需要。对比正常新生儿跟早产儿就会发现母乳、婴儿肠道与肠道微生物菌群之间存在重要的联系：（1）早产儿从母亲获得的母乳与足月儿获得的母乳有很大不同。早产儿母亲的母乳中蛋白质含量高，但跟正常新生儿母亲的母乳相比有更多不同种类的低聚糖。这些尚未成熟的低聚糖可能会改变肠道菌群的结构组成。（2）早产儿的肠道功能尚未成熟，包括其运动性、消化吸收、黏液和抗菌肽的分泌、屏障功能及血管的形成。不成熟肠道的一个显著特点是对肠道内的细菌有过度炎症反应。（3）正常新生儿和早产儿的肠道菌群之间有明显不同。与许多母乳喂养的正常新生儿相比，早产儿肠道中有许多兼性厌氧菌，而双歧杆菌和拟杆菌水平偏低，并含有大量的变形菌门细菌，尤其是肠杆菌科细菌。

3母乳糖复合物的预防保护作用

新生儿肠道发育不成熟，使婴儿更容易受到胃肠道和全身感染。越来越多的证据表明，母乳中的糖复合物也是保护新生儿重要的一员，如作为病原体的诱饵，减少毒力基因的表达，防止与宿主细胞受体的结合。有数据显示，上世纪80年代初在预防传染病的过程中母乳糖复合物起到了重要的保护作用，主要是由于其阻断病原菌对各自受体结合的能力。

3.1HMOsHMOs可以预防细菌、病毒和寄生虫所致的感染。大多数研究显示HMOs可依靠细菌与宿主之间的相互作用，阻断细菌定植。细菌粘附到哺乳动物细胞是感染过程中的第一步，是细菌传播必不可少的步骤。所以，防止疾病的前提是抗粘附作用。乳糖抗感染的经典方式是通过模仿细胞表面受体，防止细菌与宿主细胞及其受体相互作用，阻断宿主细菌和病毒定植。HMOs也对抗病毒感染有重要作用，防止病毒粘附到宿主细胞。诺如病毒（Norovirus，NV），属于杯状病毒科家族，是急性胃肠炎的主要病原体。它附着于宿主的肠上皮细胞，结合到细胞表面的糖链，包括ABO和HBGAs。因此ABO、血型和宿主分泌状态对感染的易感性起重要作用。HBGA也发现于HMOs，具有特异性Lewis和分泌抗原的HMOs能阻止诺如病毒附着HBGA抗原，母乳中高水平的乳糖-N-二岩藻六糖可以降低母乳喂养儿杯状病毒引起的腹泻。

HMOs可有效对抗肠道细菌感染。在母乳喂养儿的尿液中可发现唾液酸化的乳糖，而用奶粉喂养的婴儿尿液中却没有发现，这些糖可以全面地预防感染性疾病。最近的一项研究表明，新生儿尿路感染的发病率呈上升趋势。膀胱上皮细胞HTB-9在HMOs干预后可使尿路致病性大肠埃希菌发病率显著下降（从10%降到1.7%），且降低细胞毒性，这说明HMOs与膀胱细胞有内在联系。HMOs在感染期间阻止细胞脱离，这是尿路致病性大肠埃希菌发病机制中细菌传播的主要特征。3-sl唾液酸化HMO有调节保护作用。益生元低聚半乳糖能减少细菌的侵入，但并没有降低细胞毒性。这项研究揭示了HMOs的新机制，可能与HMOs在宿主细胞内的代谢有关。这项研究的另一个重要的方面是它直接说明通过母乳喂养获得的HMOs可扩散至全身，因此具有潜在的预防非传染性肠道疾病的能力。

3.2乳铁蛋白（LF）一些研究表明，LF可以抑制肠道致病菌的粘附。LF是一种已知的抗菌剂，其具有铁螯合性。乳铁蛋白的抗菌活性已被归因于它的糖基。乳铁蛋白是一种高度糖基化蛋白，含有岩藻糖和唾液酸。乳铁蛋白糖基化是动态的，在哺乳期的第30天会有一个增长，这时候成熟母乳产生，乳铁蛋白的糖基化修饰开始增加，随着哺乳期延长而糖基化递减。

LF还具有抗病毒活性。有报道表明LF在体外可抑制HSV-1细胞内转运过程，并在体内对抗HSV-2。Marr等人发现，通过大幅降低在Vero细胞中病毒细胞核的转运（从47%到1%），LF及其水解蛋白产物能够干预HSV-1感染周期。病毒衣壳与微管有关，病毒沿着微管的转运只是延迟而没有停止。这些蛋白质的糖基化可能是其抗病毒机制的基础。

3.3分泌型IgA（secretoryIgA，sIgA）母乳喂养期间，sIgA是母乳中的主要抗体。在出生后的第30天，母乳中的IgA是新生儿IgA的唯一来源。sIgA是胃肠道黏膜防御系统的主要成分，能抑制病原体。sIgA是肠道共生菌和上皮间肠道平衡的重要载体，限制了肠道上皮细胞的细菌定植和移位。最近一项使用小鼠模型研究表明，新生儿接触母乳的IgA对其成长发育有长期影响，早期接触母体IgA可改变断奶小鼠成年后的肠道微生物组成，改变结肠上皮的转录反应，并保护葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠损伤。接触IgA降低需氧菌移位到肠系膜淋巴结。sIgA是高度糖基化的蛋白质，含有岩藻糖、半乳糖、唾液酸和甘露糖残基。IgA糖基存在抗菌性。由于不同的残基介导细菌与宿主的相互作用不同，不同的sIgA聚糖能对抗不同的病原体。岩藻聚糖抑制EPEC粘附到Hep-2细胞，阻止幽门螺杆菌附着在胃组织。

3.4糖巨肽（GMP）在母乳消化过程中，κ-酪蛋白经历蛋白水解裂解释放GMP，这是这类糖蛋白抗菌作用的中介。κ-酪蛋白抑制肺炎链球菌和流感嗜血杆菌对人呼吸道上皮细胞的粘附。幽门螺杆菌对胃细胞抗粘附作用；α-L-岩藻糖苷酶具有降低抑制作用，说明κ-酪蛋白的岩藻糖残基在幽门螺杆菌感染介导的抗粘附作用的重要性。

3.5神经节糖苷从上世纪80年代初就首次观察到神经节糖苷可预防致病菌和真核寄生虫感染。神经节糖苷的保护作用来源于它们的糖基，其功能是在宿主细胞中作为病原体的诱饵。神经节糖苷能阻止大肠埃希菌中的不耐热肠毒素入侵和清除兔霍乱肠道模型中霍乱毒素诱导的体液积累。神经节糖苷是这些毒素的宿主细胞受体。大肠埃希菌不耐热肠毒素和霍乱弧菌肠毒素均为AB5型，有80%的氨基酸同源性。糖鞘脂Gb3（Gb3）在体外与痢疾志贺菌、肠出血性大肠埃希菌产生的志贺毒素（Stx）相互作用。Stx、AB5型毒素是肠出血性大肠埃希菌的主要毒力因子。Stx结合肾上皮细胞中GB3，引起组织破坏，由于肠出血性大肠埃希菌感染导致溶血性尿毒综合征。Stx也破坏肠上皮细胞，引起出血性结肠炎，这是肠出血性大肠埃希菌感染的一个标志。考虑到抗生素治疗不推荐用于肠出血性大肠杆菌感染，因为它提高了Stx数量，导致溶血性尿毒综合征（HUS），神经节糖苷可以用来阻止毒素进入宿主细胞受体，防止HUS感染个体。3.6乳脂肪球（MFG）粘蛋白（MUC1）是制造MFG的主要组成部分。在体外MUC1的糖基化作用可干扰艾滋病毒从黏膜树突状细胞（DC）到CD4T细胞的传输。DCs在免疫系统中作为抗原递呈细胞起着举足轻重的作用，艾滋病毒利用DC增加病毒传播。HIV包膜糖蛋白gp结合DC-SIGN，提高病毒传播到CD4T细胞。MUC1结合到DC-SIGN受体，抑制其与HIVgp作用。母乳中的天然抗体也可以阻止艾滋病毒通过DC-SIGN从DC细胞转移到CD4T细胞。母乳中IgA和IgG识别DC-SIGN碳水化合物识别结构域，能显著减少HIV对DC-SIGN表达的hela细胞的附着。研究表明，母乳糖蛋白在哺乳期对预防产后艾滋病毒传播有重要意义。在依赖唾液酸糖链的小鼠模型中母乳粘蛋白在细胞培养和胃肠炎中有抑制轮状病毒复制的功能。黏蛋白聚糖也具有抵抗致病菌的作用。

在过去的十年中，母乳中糖类的探索受到了很大的