扶肾颗粒改善肠上皮细胞屏障损伤的作用机制

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摘要：目的探讨扶肾颗粒对脂多糖（LPS）诱导的肠上皮（IEC-6）细胞屏障损伤的保护机制。方法IEC-6细胞分为对照组、模型组、扶肾颗粒组、p38MAPK抑制剂组，除对照组外，其余各组加入1μg/mLLPS，给药组分别加入10%含药血清、10μmol/Lp38MAPK抑制剂（SB）。流式细胞仪检测细胞凋亡情况；Transwell法检测细胞屏障通透性、跨膜电阻；Real-timePCR法检测细胞ICAM-1、IL-1βmRNA水平；免疫印迹检测胞质内细胞紧密连接蛋白Occludin、ZO-1和磷酸化p38MAPK、DUSP1蛋白表达的变化。结果与对照组比较，模型组IEC-6细胞凋亡、炎症因子ICAM-1和IL-1β水平显著增加（P＜0.01），紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达显著降低（P＜0.01），肠黏膜通透性显著增加（P＜0.05）。与模型组比较，扶肾颗粒能明显抑制IEC-6细胞内炎症因子ICAM-1、IL-1βmRNA水平，降低肠黏膜屏障通透性（P＜0.05），上调DUSP1、Occludin、ZO-1水平（P＜0.05、0.01），抑制p38MAPK表达（P＜0.01），与p38MAPK抑制剂作用一致。结论扶肾颗粒可能通过调控DUSP1，抑制p38MAPK信号通路的激活，上调Occludin和ZO-1，改善IEC-6细胞紧密连接，从而改善LPS引起的细胞屏障功能破坏。

肠黏膜屏障在人体营养吸收及维持内环境稳态中具有重要作用，肠隐窝上皮细胞（IEC-6）是肠黏膜屏障主要的构成细胞。完整连续的肠黏膜屏障能防御肠道细菌与毒素进入内环境，是获得性免疫系统中重要的一部分[1]。尿毒症患者由于肾功能下降，尿毒症毒素大量蓄积在肠道，形成微炎症环境，导致肠道黏膜水肿、胃肠道动力不足、免疫力下降、肠黏膜屏障受损，继而肠道功能紊乱。扶肾颗粒由黄芪、鬼箭羽、当归、熟军、仙灵脾、丹参、陈皮、半夏组成，具有健脾益肾、活血化浊之功效，为保护肾功能、改善尿毒症胃肠道功能紊乱的经验复方，临床上广泛应用于慢性肾衰竭治疗。研究证实，扶肾颗粒具有调节免疫、减少糖基化产物、改善尿毒症状态下的肠功能紊乱、改善肠道营养吸收等疗效[2-5]。扶肾颗粒对肠黏膜屏障的保护机制尚未阐明，本研究基于课题组前期实验结果[4]，以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作用于IEC-6细胞，从分子水平考察扶肾颗粒对肠黏膜上皮细胞完整性、通透性的保护作用，以期为扶肾颗粒改善尿毒症肠道功能紊乱提供理论依据。

1材料与仪器

1.1细胞

IEC-6细胞购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

1.2动物

SPF级雄性SD大鼠30只，体质量（±20）g，购自北京华阜康生物科技公司，动物合格证号SCXK（京）-。

1.3药品

扶肾颗粒由天津中医院药剂科提供。其组方药材黄芪、熟大黄（批号分别为、，安国市光明饮片加工厂）；陈皮（批号，安徽协和成药业饮片有限公司）；清半夏（批号G，天津市中药饮片厂有限公司）；淫羊藿、鬼箭羽（批号分别为、，安国圣山药业有限公司）；当归、丹参（批号分别为、，安国美津中药材有限公司）。以上中药饮片由天津中医药大学中药学院马琳教授鉴定，均符合《中国药典》年版标准。

1.4试剂

RPMI培养基、胎牛血清、青链霉素双抗（Gibco公司）；RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit、Westernshow预染蛋白Marker（ThermoScientific公司）；Hotstartfluo-PCRmixSYBRGreenⅠ、引物（IL-1β、ICAM-1、GAPDH）、高灵敏ECL发光试剂盒（上海生工生物技术有限责任公司）；山羊抗小鼠IgG-HRP二抗（中杉金桥公司）；β-actin鼠抗人单克隆抗体、p38MAPK兔单克隆抗体、Occludin兔单克隆抗体、DUSP1羊抗单克隆抗体、ZO-1兔抗单克隆抗体（Abcam公司）；0.25%胰酶、PMSF、高效RIPA细胞蛋白提取裂解液、ANNEXINV-FITC/PI凋亡检测试剂盒（北京索莱宝生物技术有限责任公司）；Transwell小室（Corning公司）；MTT染液、p38MAPK抑制剂SB、异硫氰酸荧光素右旋糖酐（fluoresceinisothiocyanate-dextran，FD4），（Sigma公司）。1.5仪器型PCR仪（ABI公司）；BX51型倒置荧光显微镜及成像系统（Olympus公司）；DG-Ⅲ型电泳仪、Mini-proteantetraelectrophoresissystem、ChemiDocXRS凝胶成像系统、PowerpacBasic电泳仪、CFX96型荧光定量PCR仪（BIO-RAD公司）；Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪（Thermo公司）；Millicel-ERS电阻仪（美国Millipore公司）。

2方法

2.1扶肾颗粒浓缩液制备

扶肾颗粒按组方比例取黄芪15g、当归10g、淫羊藿15g、陈皮10g、清半夏15g、熟大黄10g、丹参30g、鬼箭羽30g，由天津中医院中药房代煎，煎至含生药量2.02g/mL的药液mL，滤过、消毒后无菌装瓶密封，置4℃冰箱保存备用。

2.2含药血清的提取

将SPF级SD大鼠随机分为对照组、扶肾颗粒组，每组15只。对照组ig蒸馏水，扶肾颗粒组ig浓缩液（0.1g/mL），给药体积为21mL/kg，1次/d，连续1周。大鼠腹主动脉取血，×g离心15min，吸取血清，于56℃灭活30min，置?80℃保存备用[6]。

2.3IEC-6细胞的培养、分组

IEC-6细胞复苏，悬于含10%胎牛血清的RPMI培养液，接种于75cm2培养瓶，于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，当细胞融合度达到80%时传代。细胞分为对照组、模型组、扶肾颗粒组、p38MAPK抑制剂组。除对照组外，其余各组加入LPS（1μg/mL）；扶肾颗粒组在加入LPS前60min，将细胞培养液更换为10%含药血清；p38MAPK抑制剂组在加LPS前60min，加入SB（10μmol/L）孵育60min后弃去。各组孵育24h后，IEC-6细胞用于凋亡检测、RNA和总蛋白提取。

2.4IEC-6细胞凋亡检测

IEC-6细胞以PBS洗涤2次，加入μL缓冲液、5μL膜联蛋白V-FITC、5μL碘化丙锭，流式细胞仪进样检测。

2.5Real-timePCR法检测IEC-6细胞ICAM-1、IL-1βmRNA水平

弃去培养液，加入PBS洗涤2次，加入1mLTrizol试剂反复吹打，将Trizol裂解液转移至试管，室温静置5min。加入0.2mL氯仿涡漩15s，室温静置3min，4℃×g离心15min，取上层水相加入0.5mL异丙醇，室温静置10min，4℃×g离心10min。弃去上清，加入1mL75%乙醇涡旋，4℃7×g离心5min，弃去上清，于室温干燥。加入20μLRNase-freewater溶解，于?80℃保存备用。按照RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit说明书进行反转录，将cDNA样品稀释10倍作为模板，进行Real-timePCR检测，每个循环于72℃采集荧光，40个循环后测定熔解曲线。引物序列如下：IL-1β上游为5’-GCCAACAAGTGGTATTCTCCA-3’、下游为5’-CCGTCTTTCATCACACAGGAC-3’；ICAM-1上游为5’-TATGGACGCTCACCTTTAGCA-3’、下游为5’-CTCCCAGGCATTCTCTTTGA-3’；GAPDH上游为5’-CTGACTTCAACAGCGACACC-3’、下游为5’-GTGGTCCAGGGGTCTTACTC-3’。

2.6Transwell法建立肠细胞屏障模型

IEC-6细胞以1×/孔的密度接种于Transwell小室内室，倒置小室于培养箱中培养4h，小室正置于培养箱中培养5d，每2天更换1次培养液，形成双层细胞模型。

2.7IEC-6细胞屏障通透性检测

IEC-6细胞于Transwell小室中培养48h后，通过MilliporeMillicel-ERS检测细胞跨膜电阻；加入0.1nmol/LFD4检测细胞通透性，分别于0、2、4、8、10、12h吸取Transwell小室内室和下室培养液，用荧光酶标仪检测FD4浓度，计算各组IEC-6细胞对FD4的通透率，以时间为横坐标，细胞通透率为纵坐标，绘制曲线图。

细胞通透率＝(内室浓度－下室浓度)/时间

2.8免疫印迹法检测IEC-6细胞Occludin、ZO-1、磷酸化p38MAPK、DUSP1蛋白表达

IEC-6细胞以PBS洗涤3次，加入μL含PMSF的RIPA裂解液，30min后×g离心20min，吸取上清液，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样本经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，于5%脱脂奶粉封闭2.5h，分别滴加一抗、二抗孵育，加入ECL显影液曝光条带。以β-actin作为内参，通过QuantityOne软件分析。

2.9统计学分析

采用SPSS22.0统计软件，各组数据以表示。数据符合正态分布和方差齐性采用单因素方差分析，不满足正态分布采用非参数检验。

3结果

3.1扶肾颗粒对LPS致肠上皮细胞凋亡的影响

如图1所示，与对照组比较，模型组IEC-6细胞凋亡显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，p38MAPK抑制剂组、扶肾颗粒组IEC-6细胞凋亡显著降低（P＜0.01）。

3.2扶肾颗粒对IEC-6细胞ICAM-1、IL-1β表达的影响

如图2所示，与对照组比较，模型组ICAM-1、IL-1βmRNA水平显著升高（P＜0.01），提示LPS介导的炎症反应促进IEC-6细胞黏附白细胞、炎症细胞，使炎症因子穿透肠黏膜细胞屏障。与模型组比较，p38MAPK抑制剂组和扶肾颗粒组均可显著抑制ICAM-1、IL-1βmRNA水平（P＜0.01），指示扶肾颗粒可减轻IEC-6细胞炎症反应。

3.3扶肾颗粒对LPS致IEC-6细胞屏障损伤的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组IEC-6细胞FD4通透率显著增加（P＜0.05），跨膜电阻显著降低（P＜0.05），提示LPS导致IEC-6细胞屏障受损。与模型组比较，p38MAPK抑制剂组和扶肾颗粒组显著降低FD4通透率（P＜0.05），增加跨膜电阻（P＜0.05），改善LPS导致的IEC-6细胞屏障损伤情况。

3.4扶肾颗粒对IEC-6细胞Occludin、ZO-1蛋白表达的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组显著下调Occludin、ZO-1蛋白表达（P＜0.01）；与模型组比较，p38MAPK抑制剂组和扶肾颗粒组显著上调Occludin、ZO-1蛋白表达（P＜0.05）。

3.5扶肾颗粒对IEC-6细胞胞质内p-p38MAPK和DUSP1蛋白表达的影响

如图5所示，与对照组比较，模型组显著上调磷酸化p38MAPK蛋白表达（P＜0.01），显著下调DUSP1蛋白表达（P＜0.01）；与模型组比较，抑制剂组和扶肾颗粒组磷酸化p38MAPK表达明显降低（P＜0.01），DUSP1蛋白表达显著升高（P＜0.01）。

4讨论

肠道功能障碍是尿毒症临床常见并发症，尿毒症毒素和代谢性酸中毒导致肠道微炎症、肠黏膜屏障损伤、肠道功能障碍，患者出现营养不良、毒素蓄积、肠道菌群紊乱等症状，进而发展为全身炎症性反应，加重肾脏病。因此调节肠道功能紊乱是改善尿毒症患者营养状态、提高患者生存质量的有效途径。中医认为尿毒症属于脾肾亏虚、肾阳衰微之“肾衰”，为肾病迁延日久而来，日久瘀血、浊毒蕴结肠腑，导致肠腑不畅，治疗应以扶正驱邪为主。课题组前期研究发现扶肾颗粒可改善肾衰、尿毒症腹膜透析患者的生存质量和肠道功能，并网络药理学预测出IL-1β/p38MAPK可能是扶肾颗粒的相关作用靶点。因此，本研究以LPS刺激IEC-6细胞模拟肠黏膜屏障功能损伤，进一步探索扶肾颗粒保护肠黏膜屏障的作用机制。

紧密连接是一种肠黏膜上皮细胞间特殊的结构，由不同功能的蛋白质（如Occludin、ZO-1等）组成并包绕在细胞腔侧端，受细胞因子高度调节并影响肠黏膜屏障通透性[7]。紧密连接可有效阻止肠腔内细菌、毒素、炎性介质等物质的旁细胞转运，维持肠黏膜上皮屏障功能完整，并参与粒子、离子的定向转运和蛋白转运。p38MAPK是重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号转导通路，在细胞分化、凋亡、迁移、增殖中发挥重要作用。尿毒症微炎症环境下，促炎介质、细胞因子激活p38MAPK信号通路，增加肠黏膜上皮细胞通透性，导致肠黏膜屏障功能破坏[8]。研究表明，多器官功能障碍综合征患者中肠上皮细胞p38MAPK信号通路活化，上调iNOS、NO水平，并影响紧密连接蛋白的表达，从而导致肠道屏障通透性增加[9]。因此，p38MAPK通路作为肠黏膜细胞内信号传导经典调控通路，对预防和治疗尿毒症肠道功能紊乱有重要作用。

ICAM-1是介导黏附反应的重要黏附分子，在稳定细胞间相互作用中起到重要作用[10]。IL-1β是参与组织破坏、水肿形成等的致炎因子之一[11]。结果表明，LPS可激活p38MAPK信号通路，抑制Occludin、ZO-1表达，增加ICAM-1、IL-1β水平，增加肠屏障通透性并减弱跨膜电阻，造成肠黏膜屏障功能损伤；扶肾颗粒可抑制IEC-6细胞ICAM-1、IL-1β的表达，降低肠黏膜屏障的通透性，改善肠黏膜屏障功能破坏，并与p38MAPK抑制剂作用一致，指示扶肾颗粒肠黏膜屏障的保护作用与抑制p38MAPK信号通路活化，继而上调Occludin、ZO-1有关。

综上，本研究初步探讨了扶肾颗粒治疗尿毒症肠功能紊乱的作用机制，为扶肾颗粒临床应用提供了一定的实验依据，其上游机制及药物作用靶点将在后期研究中进行深入探讨。

参考文献（略）

来源：姜晨，杨洪涛，耿芳，刘睿昕，忽星歌．扶肾颗粒改善肠上皮细胞屏障损伤的作用机制研究[J].中草药,,51(21):-5.

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