英夫利西单克隆抗体对克罗恩病患者肠黏膜屏

中华消化杂志,,40(08)赵玉洁,王奕文,王东,等

摘要

目的

探讨英夫利西单克隆抗体(IFX)对CD患者肠黏膜屏障的修复作用。

方法

选择年1月至年10月医院就诊的CD患者例，均行IFX治疗，另选择名行结肠镜检查者作为健康对照组。收集CD患者和健康对照者的一般临床资料、空腹血和肠黏膜组织样本，计算BMI，检测血红蛋白、白蛋白、ESR、CRP，以及相关炎症因子TNF-α、γ干扰素、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A表达水平及其mRNA水平。采用克罗恩病疾病活动指数(CDAI)和克罗恩病简化内镜评分(SES-CD)评价CD患者的疾病活动度。采用蛋白质印迹法分析闭锁蛋白、紧密连接蛋白-1、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和连接黏附分子-A(JAM-A)表达水平。通过透射电子显微镜观察肠黏膜上皮细胞。统计学分析采用t检验。

结果

CD患者治疗前BMI、血红蛋白、白蛋白水平均低于健康对照组[(18.3±1.8)kg/m2比(20.2±1.2)kg/m2、(95.3±8.4)g/L比(.2±5.7)g/L、(33.2±5.4)g/L比(50.3±3.2)g/L]，差异均有统计学意义(t＝3.、5.、2.，P均0.05)。CD患者治疗后BMI和血红蛋白水平均高于治疗前[(19.5±2.1)kg/m2比(18.3±1.8)kg/m2、(.2±10.3)g/L比(95.3±8.4)g/L]，CRP水平、CDAI评分、SES-CD评分均低于治疗前[(16.3±2.3)mg/L比(47.2±9.3)mg/L、(.2±12.5)分比(.2±23.5)分、(5.0±2.1)分比(10.0±4.3)分]，差异均有统计学意义(t＝2.、2.、2.、6.、5.，P均0.05)。健康对照组促炎因子TNF-α、γ干扰素、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17A表达水平及其mRNA水平均低于CD患者治疗前[分别为(1.1±0.4)ng/L比(.2±38.3)ng/L、(3.2±0.8)ng/L比(28.3±13.4)ng/L、(2.7±1.3)ng/L比(3.3±2.4)ng/L、(5.2±0.3)ng/L比(16.3±7.4)ng/L、(16.3±6.3)ng/L比(18.9±10.2)ng/L、(10.5±2.3)ng/L比(38.5±11.2)ng/L；1.00±0.00比4.68±0.34、7.83±0.32、1.25±0.46、8.36±0.44、2.01±0.89、6.83±0.53]，差异均有统计学意义(t＝2.、6.、3.、4.、7.、10.，8.、11.、1.、12.、5.、5.；P均0.05)。CD患者治疗后TNF-α、γ干扰素、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17A表达水平及其mRNA水平均低于治疗前[分别为(.4±29.9)ng/L比(.2±38.3)ng/L、(25.7±10.8)ng/L比(28.3±13.4)ng/L、(2.9±1.7)ng/L比(3.3±2.4)ng/L、(15.4±4.2)ng/L比(16.3±7.4)ng/L、(17.2±8.7)ng/L比(18.9±10.2)ng/L、(29.9±12.7)ng/L比(38.5±11.2)ng/L，2.45±0.21比4.68±0.34、3.75±0.18比7.83±0.32、1.09±0.22比1.25±0.46、3.78±0.21比8.36±0.44、1.67±0.33比2.01±0.89、2.96±0.11比6.83±0.53]，差异均有统计学意义(t＝9.、2.、2.、2.、3.、8.，4.、6.、2.、7.、3.、8.；P均0.05)。蛋白质印迹法结果显示，CD患者治疗前肠黏膜组织中的闭锁蛋白、紧密连接蛋白-1、ZO-1和JAM-A表达水平均低于健康对照组(0.21±0.03比1.00±0.02、0.17±0.07比1.00±0.01、0.16±0.06比1.00±0.04、0.26±0.08比1.03±0.04)，CD患者治疗后闭锁蛋白、紧密连接蛋白-1、ZO-1和JAM-A的mRNA水平均高于治疗前(0.77±0.08比0.21±0.03、0.69±0.08比0.17±0.07、0.78±0.09比0.16±0.06、0.72±0.07比0.26±0.08)，差异均有统计学意义(t＝4.、6.、5.、8.，9.、8.、10.、7.；P均0.05)。

结论

IFX能有效缓解CD患者病情活动，改善其营养状态，可通过减轻CD患者体内的炎症反应，维持肠上皮紧密连接蛋白的表达，修复CD患者的肠黏膜屏障。

CD是以肠道全层透壁性炎症为特征的慢性炎性肉芽肿性疾病，其临床表现多样，以腹痛、腹泻、体质量减轻为特点，可伴有全身，以及眼、皮肤、口腔黏膜、关节等肠外损害。CD是遗传、环境和免疫系统等多种因素综合作用的结果，主要为环境因素作用于遗传易感者，启动了发作与缓解交替的肠道天然免疫与获得性免疫反应，导致肠黏膜屏障损伤[]。因此，肠黏膜屏障的修复是治疗CD的关键。针对CD发生过程中过度的Th1免疫反应所产生的大量促炎细胞因子，如TNF-α和γ干扰素等，开发了一系列具有靶向作用的生物免疫制剂，其中抗肿瘤坏死因子单克隆抗体英夫利西单克隆抗体(infliximab，IFX)是首个被批准应用于临床治疗CD的生物制剂[。IFX在中国正式上市并投入使用已10余年，其临床疗效较好，但对患者肠黏膜修复的研究，尤其是分子生物学的研究尚不多见。基于此，本研究通过对CD患者使用IFX前后的临床生物化学指标、肠道黏膜组织病理学表现，以及肠上皮紧密连接的超微结构的透射电子显微镜下表现进行分析，探索IFX对CD患者肠黏膜屏障功能修复的作用，并为其治疗CD的机制提供临床证据。

对象与方法一、研究对象

选择年1月至年10月医院就诊的CD患者。纳入标准：CD的诊断符合中华医学会消化病学分会IBD学组制定的《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(年，北京)》[]；基本情况、病史资料、血清学检查、内镜检查、影像学检查资料均完整。排除合并严重心、肺、肝、肾疾病患者。最终纳入例CD患者，另选择名年龄、性别相匹配的行结肠镜检查者作为健康对照组。本研究通医院伦理委员会审核批准。

二、主要试剂

IFX购自西安杨森制药有限公司。PCRTaKaRa试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由上海捷瑞生物有限公司合成；免疫组织化学染色相关抗体闭锁蛋白、紧密连接蛋白-1、闭锁小带蛋白-1(zonulaoccluden-1，ZO-1)和连接黏附分子-A(junctionaladhesionmolecule-A,JAM-A)均购自美国CellSignalingTechnology公司；苏木精染料、二甲苯、甲醇、乙醇等化学试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

三、研究方法1．临床资料：

所有CD患者均接受IFX治疗，诱导期5mg/kg，第0、2、6周给药1次；维持期5mg/kg，每8周给药1次。记录CD患者的性别、年龄、病程、疾病分型和肠外表现等临床特征，测量患者身高、体质量，计算BMI；晨6：00抽取CD患者和健康对照者空腹静脉血，检测血红蛋白、白蛋白、ESR、CRP，以及相关炎症因子TNF-α、γ干扰素、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A等表达水平。根据蒙特利尔分类标准进行分型；临床疾病活动性的评估采用克罗恩病疾病活动指数(Crohn′sdiseaseactivityindex,CDAI)，CDAI评分≥分为活动期，CDAI评分分为缓解期。采用克罗恩病简化内镜评分(simplifiedendoscopicscoreforCrohn′sdisease，SES-CD)评价CD患者的内镜下病变缓解程度，包括溃疡大小、溃疡病变累及的肠段长度和肠腔狭窄。SES-CD为各肠段评分之和，≤3分为缓解，4～10分为轻度活动，11～19分为中度活动，≥20分为重度活动。病理结果根据组织学炎症水平分为4级，0级为炎症消失，1级为轻度炎症，2级为中度炎症，3级为重度炎症。

2．标本获取和处理：

所有CD患者在接受结肠镜检查时，于肠黏膜炎症病变部位取5～7块活组织检查(以下简称活检)标本，其中2块活检组织以4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、H-E染色，行常规病理组织学检查；2块活检组织以2.5%戊二醛溶液固定，脱水、包埋、切片，透射电子显微镜下观察；2～3块活检组织置于液氮中保存，用于提取总RNA和蛋白质，进行实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分析。

3．实时荧光定量PCR：

用TRIzol一步法提取结肠组织RNA，采用SYBRGreenⅠ荧光染料嵌合法检测TNF-α、γ干扰素、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A的mRNA，各引物序列见表1。先构建目的基因和管家基因的RNA标准品，制作标准曲线，利用标准曲线对样品中的目的基因和管家基因分别进行定量。通过管家基因的校正，检测结肠组织中目的基因的相对表达水平。

表1实时荧光定量聚合酶链反应的引物序列

4．蛋白质印迹法：

取约mg结肠组织置于0.5mL蛋白质裂解液中，于冰上超声粉碎机下将组织粉碎，匀浆置于4℃冰箱过夜，×g4℃离心10min，取上清液。采用二辛可宁酸法定量分析蛋白质样品，将30μg/mL蛋白质样品加入μL上样缓冲液，沸水煮5min进行蛋白质变性处理。取80μg总蛋白质进行SDS-PAGE，电泳后将蛋白质转至硝酸纤维素膜上，mA转膜1h，脱脂奶粉溶液封闭2h，加入闭锁蛋白、紧密连接蛋白-1、ZO-1和JAM-A第一抗体4℃过夜；然后加入荧光标记的羊抗兔第二抗体室温孵育2h，碱性磷酸酯酶显色液显色，约10min，蒸馏水终止反应，结果以GAPDH为内参照进行评价。

5．透射电子显微镜观察：

取大小约1mm3的结肠组织在4℃下以2.5%戊二醛溶液固定4h，0.1mol/LPBS漂洗3次，1%锇酸溶液固定1.5h，0.1mol/LPBS漂洗3次，然后以30%、50%、70%、90%乙醇逐级脱水，%丙酮逐级脱水3次。将%丙酮与环氧树脂包埋剂以1∶1混合，置换2h。再将结肠组织置包埋模内以Epon包埋剂包埋，60℃聚合48h。运用超薄切片机切厚度为70nm的超薄切片。采用70%乙醇配制的饱和醋酸双氧铀染色3min，双蒸水漂洗，柠檬酸铅染液染色3min，双蒸水漂洗。室温下待超薄切片干燥后用JEM-2透射电子显微镜(日本电子株式会社)观察肠黏膜上皮细胞。

四、统计学方法

应用SPSS22.0软件进行统计学分析，呈正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验；计数资料以例数和百分数表示；配对等级资料以频数表示，比较采用秩和检验。P0.05为差异有统计学意义。

结果一、CD患者的一般情况

例CD患者中，男例(67.5%)，女例(32.5%)，年龄为(25.3±7.1)岁，病程为(8.0±4.2)年，BMI为(18.3±0.8)kg/m2。根据蒙特利尔分类标准，确诊年龄≤16岁18例(4.7%)，17～40岁例(85.1%)，40岁39例(10.2%)；位于回肠末端例(31.9%)，结肠59例(15.4%)，回结肠例(44.8%)，累及上消化道30例(7.9%)；根据疾病行为，非狭窄非穿透型例(51.8%)，狭窄型例(27.0%)，穿透型81例(21.2%)。有42例(11.0%)患者因不完全肠梗阻、完全肠梗阻或肠穿孔行外科手术治疗；例(38.2%)患者伴肛周病变；77例(20.2%)患者伴肠外表现，其中口腔溃疡61例(16.0%)，关节受累4例(1.0%)，肝胆系统受累3例(0.8%)，皮肤病变6例(1.6%)，泌尿系统病变2例(0.5%)，眼部病变1例(0.3%)；21例(5.5%)患者伴消化道出血，3例(0.8%)患者合并甲状腺肿瘤；1例(0.3%)患者合并中毒性巨结肠；32例(8.4%)患者有吸烟史。

二、CD患者IFX治疗前后生物化学指标和疾病活动度

例CD患者使用IFX的治疗次数(范围)为(11.8±4.7)次(3～26次)，有62例(16.2%)患者合并使用美沙拉秦，例(59.4%)合并使用免疫抑制剂，例(36.6%)使用糖皮质激素。见表2，CD患者治疗前BMI、血红蛋白、白蛋白水平均低于健康对照组，差异均有统计学意义(t＝3.、5.、2.，P均0.05)；CD患者治疗后BMI和血红蛋白水平均高于治疗前，CRP水平和CDAI评分均低于治疗前，差异均有统计学意义(t＝2.、2.、2.、6.，P均0.05)；而白蛋白水平和ESR与治疗前比较差异均无统计学意义(P均0.05)。

表2健康对照者和CD患者治疗前后生物化学指标和疾病活动度比较(±s)

三、CD患者IFX治疗前后内镜下表现和组织病理学改变

例CD患者中，例(70.2%)患者治疗前后进行了内镜检查，有例(36.4%)患者治疗前后均有病理活检结果。患者治疗前后进行2次内镜检查的间隔时间(范围)为(32.0±10.4)周(6.5～80.0周)。见图1，CD患者治疗前内镜检查结果示肠黏膜呈跳跃性纵行溃疡，表面覆白苔，部分有肠腔狭窄，治疗后溃疡明显愈合，可形成炎性息肉。见图2，H-E染色结果显示，CD患者治疗前局灶类上皮细胞聚集，淋巴滤泡形成，固有层大量浆细胞和中性粒细胞浸润，治疗后患者炎症细胞浸润减少，炎症反应明显降低。CD患者治疗后SES-CD评分低于治疗前[(5.0±2.1)分比(10.0±4.3)分]，差异有统计学意义(t＝5.，P0.05)；例CD患者治疗前均为重度炎症，治疗后例患者炎症消失，47例为轻度炎症，99例为中度炎症，50例为重度炎症，治疗前后炎症等级频数比较差异有统计学意义(Z＝7.，P＝0.)。

图1克罗恩病患者英夫利西单克隆抗体治疗前后内镜下表现　A　治疗前　B　治疗后

图2克罗恩病患者英夫利西单克隆抗体治疗前后病理表现　苏木精-伊红染色　高倍放大　A　治疗前　B　治疗后

四、CD患者IFX治疗前后体内炎症因子变化

见表3，健康对照组促炎因子TNF-α、γ干扰素、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17A表达水平及其mRNA水平均低于CD患者治疗前，差异均有统计学意义(t＝2.、6.、3.、4.、7.、10.，8.、11.、1.、12.、5.、5.；P均0.05)；CD患者治疗后TNF-α、γ干扰素、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17A表达水平及其mRNA水平均低于治疗前，差异均有统计学意义(t＝9.、2.、2.、2.、3.、8.，4.、6.、2.、7.、3.、8.；P均0.05)；而健康对照组与CD患者治疗前，以及CD患者治疗前后IL-1和IL-10表达水平及其mRNA水平比较差异均无统计学意义(P均0.05)。

表3健康对照者和CD患者治疗前后体内炎症因子表达水平及其mRNA水平的比较(±s)

五、CD患者IFX治疗前后肠黏膜中相关紧密连接蛋白的变化

见图3，透射电子显微镜下结果显示，CD患者结肠黏膜上皮细胞微绒毛分布不均、长短不一，微绒毛断裂，紧密连接明显增宽，溶酶体增多；健康对照组结肠黏膜上皮细胞形态正常且连接紧密，细胞膜结构完整，微绒毛排列紧密而整齐，细胞质内线粒体双层膜结构完整清晰；CD患者治疗前结肠黏膜上皮细胞微绒毛数量减少，有断裂现象，紧密连接不清晰，有明显增宽现象，细胞质内含有大量分散的黏液颗粒，线粒体膨大空洞，内部双层膜结构不完整；CD患者治疗后微绒毛减少的情况有所改善，紧密连接增多且无增宽，线粒体形态接近正常且其双层膜结构完整清晰。

图3肠黏膜组织中紧密连接蛋白的透射电子显微镜下表现　高倍放大　A　健康对照组　B　克罗恩病患者治疗前　C　克罗恩病患者治疗后

见图4，蛋白质印迹法显示，CD患者治疗前闭锁蛋白、紧密连接蛋白-1、ZO-1和JAM-A表达水平均低于健康对照组(0.21±0.03比1.00±0.02、0.17±0.07比1.00±0.01、0.16±0.06比1.00±0.04、0.26±0.08比1.03±0.04，n＝6)，CD患者治疗后闭锁蛋白、紧密连接蛋白-1、ZO-1和JAM-A的mRNA水平均高于治疗前(0.77±0.08比0.21±0.03、0.69±0.08比0.17±0.07、0.78±0.09比0.16±0.06、0.72±0.07比0.26±0.08，n＝6)，差异均有统计学意义(t＝4.、6.、5.、8.，9.、8.、10.、7.；P均0.05)。

图4肠黏膜组织中相关紧密连接蛋白的表达水平

讨论

CD是可以发生在消化道任何部位的慢性非特异性炎症性疾病，全球CD发病率越来越高。CD可能由于遗传易感性、环境因素和肠道微生物群改变间相互作用，导致先天性和适应性免疫反应失调。目前的治疗策略主要着眼于深度和长期缓解，目的是预防并发症，阻止疾病进展[]。这些治疗策略的核心是在高危患者中早期引入生物制剂，结合严密的病理学改变和血液检验监测结果，并在病情评估的基础上调整治疗方案[]。

CD患者最常见的临床表现是反复腹痛、慢性腹泻和体质量减轻。本研究例CD患者中，发病年龄多为17～40岁(占85.1%)，38.2%的患者有肛周疾病，而20.2%的患者合并皮肤、关节或眼部的肠外表现。CD患者一般存在不同程度的营养不良、脱水、贫血和低蛋白血症等全身症状，这与Mosli等[]的研究结果一致。

TNF-α是一种具有广谱生理和病理效应的细胞因子，主要由单核细胞和巨噬细胞分泌，在IBD的发生中起重要作用[]。抗TNF-α药物可诱导肠上皮细胞凋亡和细胞间紧密连接蛋白装配功能改变，参与黏膜固有层炎症反应和上皮细胞脱落，导致肠上皮通透性增加，从而影响肠黏膜屏障的防御功能[]。此外，受炎症反应刺激后，TNF-α大量表达，可诱导β防御素表达，上调结肠上皮β防御素mRNA转录，进而发挥肠上皮防御作用[，保护肠道表面免受微生物的侵袭，也从侧面证明TNF-α可改变肠上皮屏障功能，影响其通透性。抗TNF-α抗体通过与TNF特异性结合，封闭结肠黏膜局部淋巴细胞征集，促进ZO-1等黏附分子下调，也有研究发现应用TNF-α抗体可使表达TNF的炎症细胞凋亡，从而使黏膜炎症消退，修复肠上皮细胞通透性，促进黏膜愈合[]。

本研究发现经IFX治疗后CD患者的BMI上升，营养和贫血状态均明显改善，内镜下溃疡范围明显缩小，病理切片中炎症细胞浸润比例出现一致性下降，说明IFX对CD患者的肠黏膜修复具有明显的缓解作用。CD患者的肠黏膜受损，肠道通透性增加，细菌和氧化应激产物侵入使肠道自然免疫和获得性免疫反应被激活，从而释放出大量的促炎因子，如TNF-α、γ干扰素、IL-1β等。CD中TNF-α等炎症因子水平升高，与病情的严重程度密切相关[]。γ干扰素和IL-1β等其他炎症因子也通过不同的机制作用于肠黏膜，引起非特异性炎症反应[]。炎症因子水平与CD疾病活动密切相关。本研究发现CD患者治疗前的促炎因子TNF-α、γ干扰素、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17A水平高于健康对照组，经IFX治疗后则降低，这可能是IFX拮抗了TNF-α、γ干扰素、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17A的作用，进一步抑制巨噬细胞等，从而抑制了其他炎症因子的释放。

CD的发生与肠黏膜屏障的改变密切相关。闭锁蛋白、紧密连接蛋白家族和ZO-1在紧密连接蛋白修复中的表达对CD的改善具有重要意义[]。Marano等]研究发现用TNF-α处理Caco2细胞可导致紧密连接结构的破坏。Ma等]进一步证明，TNF-α不仅可以降低ZO-1的表达，而且可以降低ZO-1的磷酸化，使其从紧密连接处解聚，促进紧密连接断裂。本研究发现紧密连接分子的表达与TNF-α等炎症因子表达趋势相反，这可能是TNF-α通过MAPK家族、细胞肌球蛋白轻链激酶和蛋白激酶C等通路作用于相应的下游靶标，减少紧密连接分子的转录和表达，使紧密连接断裂，从而进一步损伤肠黏膜屏障功能[]。这说明IFX可通过拮抗TNF-α，对肠上皮细胞紧密连接分子起重要的调控作用，从而进一步改善肠黏膜屏障，缓解CD的炎症活动，这可能是IFX治疗CD的重要机制之一。

综上所述，生物制剂作为一种治疗CD的新型药物，自临床应用以来，大大提高了CD的临床缓解率和黏膜愈合率，改善了患者的生命质量。本研究对IFX在CD患者体内的作用机制进行了探索，证明IFX可通过拮抗TNF-α、γ干扰素、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17A而上调肠道上皮紧密连接蛋白的表达，改变紧密连接蛋白的结构和空间分布，促进肠黏膜修复，并降减轻体内炎症反应，缓解临床炎症活动，为IFX的临床治疗机制提供了有力的理论支持。

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