人体的自然止血可以通过止血技术的发展来增强，并且已经开发出许多止血材料，包括基于纤维蛋白的胶或密封剂，沸石粉末，交联的明胶基质等。基于胶原的止血材料因其优异的生物相容性，低毒性和弱抗原性而被广泛用于止血目的。这些天然存在的有利特性使基于胶原的材料成为控制出血的有前途的解决方案，市场上已经有多种商业产品可用。
当前，两种通用方法用于制备基于胶原的水凝胶。由于胶原蛋白分子组装体的无序结构，通过常规的反复冷冻干燥方法制备的胶原蛋白水凝胶通常易碎且柔韧性较低，强度低。当通过原位凝胶形成（胶原蛋白自聚集方法）形成凝胶时，这些材料在胶原分子的分散状态中具有可逆的变化，导致从溶液到凝胶的相变。胶原蛋白的自聚集可引起基于胶原蛋白的水凝胶的热响应特性。这对于促进伤口闭合和出血控制很重要。具体而言，液态能够在伤口部位实现出色的可塑性和快速的相变，从而形成高亲水性凝胶的3D网络结构。相变过程可在生理温度下发生，导致形成粘性凝胶并阻塞治疗伤口的出血部位。
大量失血会导致无法控制的出血，从而带来巨大的死亡风险。因此，当前的紧急止血处理（包括用纱布加压或“被动”输血）远非理想，而最新开发的止血剂仍具有共同的局限性，而未考虑治疗后的组织修复和抗菌活性。最近，陕西科技大学讲师刘新华/副校长王学川携手哈佛大学教授郭俊凌等研究人员介绍了一种新型的生物启发的聚集的胶原蛋白纳米纤维为基础的生物相容性和高效止血水凝胶材料（TS-Gel-Ag-col），它是通过模拟粘液模拟的泊洛沙姆，聚乙烯吡咯烷酮和树胶素/壳聚糖二醛协同交联的聚集体的多功能化合物制备的胶原纳米纤维装饰有银纳米颗粒。水凝胶的表征以及体外和体内研究表明，这些材料具有有效的抗出血和抗菌伤口保护作用。而且，TS-Gel-Ag-col可以通过促进血管再生来促进皮肤伤口的组织修复。对于下一代基于胶原的可吸收止血材料以及智能人造皮肤的开发具有广阔的前景。相关论文ThermoresponsiveHemostaticHydrogelwithaBiomimeticNanostructureConstructedfromAggregatedCollagenNanofibers发表在《Biomacromolecules》上。
洞察TS-Gel-Ag-Col凝胶成分之间的相互作用
TS-Gel-Ag-col组分之间的分子间相互作用可能对Ag-col的特定性质产生很大影响。图1a显示了基于生物启发的聚集胶原蛋白纳米纤维的生物相容性和高效止血水凝胶（TS-Gel-Ag-col）的制备方案。其中证实聚集蛋白由典型的D周期交叉条纹的胶原蛋白纳米纤维和通过SEM和AFM分析获得厚的胶原蛋白纳米纤维束（图1b）。TS-Gel-Ag-col在不同F-剂量下的FT-IR光谱（图1c）显示胶原分子骨架中酰胺A，B，I，II和III谱带的特征吸收峰。不同F-剂量下TS-Gel-Ag-col的XRD图谱仅显示F-的衍射峰（图1d）。与文献相符，两个强和尖锐的结晶峰分别出现在水平和垂直方向，分别代表F-分子的重复单体结构，分别位于19°和23°。未观察到Ag-col的无定形衍射峰，可能是因为F-凝胶中的高浓度可能完全包裹了Ag-col的纤维表面。
图1
微形貌和相变分析
临界胶束温度（CMT）是对温度敏感的原位凝胶的重要性能。对于不同的F-量（图2a）和相应的微分曲线（图2b），评估了弹性模量（G）对TS-Gel-Ag-col对温度（T）的依赖性。随着F-用量的增加，弹性模量有所提高。CMT随着F-的增加而降低（图2）。在F-浓度为15％，20％，25％和30％的条件下，TS-Gel-Ag-col的CMT分别为45°C，43°C，37°C和34°C。因此，当F-剂量超过25％时，TS-Gel-Ag-col可在生理温度下发生相变。通常，弹性模量越高，凝胶强度越强；反之，凝胶强度越强。实际上，增加F-的浓度会增加凝胶强度。当F-增加到25％时，TS-Gel-Ag-col弹性模量约为0.1MPa，该值有利于伤口的快速愈合和二次出血的预防。
图2
细胞相容性和抗菌性能的评估
考虑到促进伤口愈合所需的潮湿环境也有利于细菌和微生物的生长和繁殖，赋予水凝胶以抗菌/抑菌特性是主要的研究重点。在不同的F-剂量下，TS-Gel-Ag-col对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制区直径的影响如图3a所示。添加AgNPs后，TS-Gel-Ag-col对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌/抑菌作用，其中F-的量对TS-Gel-Ag-col的抗菌/抑菌特性没有显着影响。此外，不含AgNPs的TS-Gel-Ag-col（对照组）也显示出一定的抗菌/抑菌特性，证实了二醛壳聚糖可以赋予Ag-col以抗菌/抗菌特性，同时实现Ag-col的功能交联。
图3
体外和体内止血性能评估
图4b显示了在不同F-剂量下TS-Gel-Ag-col的APTT，PT和TT，表明F-含量对TS-Gel-Ag-col的APTT，PT和TT没有影响，并进一步确认F-不参与内源性和外源性凝血过程。如前所述，胶原蛋白的凝结过程高度依赖于凝结因子，因此无法在特殊血液疾病患者中发挥止血作用。不过，在TS-Gel-Ag-col中，OCS可以进行间接止血，而不受人体凝血因子的影响，并且不参与传统的“瀑布”模型止血过程。PVP主要起亲水作用，对生理凝血过程没有影响。F-主要通过相变来止血，形成阻止伤口出血的凝胶，即物理止血，因此其作用与凝血因子的激活无关。因此，TS-Gel-Ag-col中胶原蛋白与F-和PVP的结合降低了止血对凝血因子的依赖性。总CT可以反映出TS-Gel-Ag-col在体外的凝血作用（图4a）。随着F-含量的增加，CT表现出明显的下降趋势，尤其是在25％以上时。这可能是因为温度达到37°C时结合胶凝时间分析，TS-Gel-Ag-col可以快速形成凝胶相转变3D网络凝胶结构为血小板粘附和聚集提供了丰富的空间，从而导致CT显着降低。因此，F-的物理止血作用在TS-Gel-Ag-col的止血特性中起着重要作用，高浓度的凝胶能够在凝结的初始阶段迅速改变并阻止血液流动。通过SEM观察到凝结后凝块的微观结构（图4c）。血细胞，尤其是血小板聚集在TS-Gel-Ag-col表面或网络中，并与凝胶紧密相连，表明血细胞可以在其表面培养，并允许内部粘附和聚集，对于形成血栓形成至关重要。此外，综合利用三种类型的创伤性出血模型（大鼠肌肉创伤，肝脏和兔耳动脉损伤）来评估体内的止血性能（图4d）。结果清楚地表明，与商业Helitene胶原止血材料相比，TS-Gel-Ag-col止血速度明显更快。
图4
组织病理学观察
通过HE和Masson染色在不同时间间隔对TS-Gel-Ag-col-，TS-Gel-Col-和凡士林纱布处理的伤口进行组织学观察（图5）。术后1周在伤口中观察到不同程度的炎症反应。然而，TS-Gel-Ag-col和TS-Gel-Col组均显示出极少的炎症，而空白组（凡士林纱布）显示出强烈的炎症，大量的炎症细胞聚集在伤口愈合部位，炎性细胞浸润。术后2周，TS-Gel-Ag-col和TS-Gel-Col组的炎性细胞浸润明显减少，伤口的真皮层基本得到修复。此外，基底细胞排列整齐并观察到更多小血管的存在。值得一提的是，TS-Gel-Ag-col组的表皮层甚至表现出基本修复的完整性，并且新生胶原纤维的编织更为紧密。最后，在术后3周，TS-Gel-Ag-col和TS-Gel-Col组的皮肤结构已完整形成，基底细胞呈单层紧密排列，真皮中成纤维细胞数量增加。幸运的是，在TS-Gel-Ag-col组中，新的皮肤表皮较厚，真皮胶原纤维水平排列，且编织方式紧密。总体而言，TS-Gel-Ag-col和TS-Gel-Col都能促进组织的伤口愈合，前者的作用更为明显。聚合Col可以促进成纤维细胞和血管内皮细胞的生长和增殖，从而加快伤口修复。
图5
以二醛壳聚糖为还原剂和稳定剂，用AgNPs制备了一种利用F-热反向凝胶化特性的新型基于胶原纳米纤维聚集体的原位多功能凝胶。结果表明，TS-Gel-Ag-Col中的PVP，F-和Ag-Col通过物理分子间氢键键合。新形成的氢键网络改善了TS-Gel-Ag-Col的热稳定性。同时，用25％F-制备的TS-Gel-Ag-Col在20s的人体生理温度下能够完成从溶液到凝胶的相变，通过形成物理屏障发挥出色的止血作用。材料的相应弹性模量达到约0.1MPa，因此能够有效地防止凝胶在与血液接触时被稀释或洗掉。TS-Gel-Ag-Col展示了具有相互连接的空腔的3D多孔网络结构和具有纵向间隙的分层3D结构。而且，AgNP均匀地分散在凝胶的表面和内部，平均粒径为60nm。细胞相容性，抗菌/抑菌性能和体外凝血性能的结果表明，浓度为5ppm的AgNPs的TS-Gel-Ag-Col具有优异的生物相容性和抗菌/抑菌活性。将F-的浓度调整为25％时，TS-Gel-Ag-Col的体外总凝结时间约为20s。最重要的是，体内动物实验表明，相对于TS-Gel-Col，TS-Gel-Ag-Col更好地促进了皮肤伤口组织的再生和修复。总之，TS-Gel-Ag-Col有潜力成为新一代基于胶原的可吸收止血生物材料，而Ag-col可以作为当前常规胶原材料的更好替代来源，用于进一步的生物医学甚至人工合成皮肤材料的应用。
参考文献：doi.org/10./acs.biomac.0c
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