肠道菌群与肠上皮细胞和肠道免疫系统的相互

武庆斌（医院消化科苏州）

哺乳动物的胃肠道寄生着最为复杂的微生物群体，被称之为肠道原籍菌群，新近的研究认为这些细菌有近多种。新生儿出生时胃肠道是无菌的，免疫系统几乎没有发育，但很快有种类繁多的细菌定植。随着细菌的定植，肠道菌群的建立，刺激机体产生大量的淋巴细胞和淋巴组织，促进全身免疫系统和粘膜免疫系统的正常发育并逐步成熟，这其中也包括肠相关淋巴组织（gut-associatedlymphoidtissues，GALTs）的发育和成熟。GALTs发育成熟的结果是对肠道原籍菌群的耐受和对病原菌的免疫反应。由于宿主基因易感性，肠道粘膜屏障功能减弱或缺乏恰当的粘膜免疫反应（如免疫耐受丢失），就会导致粘膜对肠道菌群免疫反应失控，甚至引起全身免疫反应紊乱，引起慢性持续性的炎症，如过敏性炎症和炎性肠病（inflammatoryboweldisease,IBD）就是例证[1，2]。

一、肠道菌群对婴幼儿粘膜免疫的作用

和肠道菌群的建立、定植和演替一样，出生时GALTs的活性较低，与新生儿期间，全身免疫系统短时间不成熟是一致的[3，4]。新生儿生后，其外周血中几乎测不到分泌IgA的B型浆细胞——推测这种B细胞是由GALTs衍生出来，然后随血流到达粘膜效应部位。一个月后，这些细胞显著增加，12个月后达到最高峰值。这就意味着有持续不断的微生物和外界环境对GALT的刺激所致。无菌鼠的PP结（Peyer’spatches）发育程度低下：仅有极少的生发中心，数量很少的淋巴细胞，主要是CD4+T细胞、α-βTCRCD8+细胞和分泌IgA浆细胞；脾脏和淋巴结的少有B-和T-细胞带或区域，异常内皮微血管的过度增生，以致结构不完整[5]。正常的口服饮食抗原免疫耐受能力缺失。恢复大龄无菌鼠的正常肠道菌群，食物抗原的免疫耐受功能依旧缺失。这说明在很早的初级阶段，肠道菌群的建立、定植和成熟，对先天免疫系统和获得免疫的启动有着极其重要的作用。的确肠道菌群通过“入侵”肠上皮细胞和M细胞，对GALTs的发育起着很重要的作用。Gronlund等[6]研究0～6个月的健康的新生儿时，发现肠道内脆弱类杆菌和双歧杆菌定植的时间越早，外周血中IgA定向细胞的含量可以越早地被检测到；随着肠内脆弱类杆菌和双歧杆菌数目的增加，外周血中的IgA定向细胞的数量也逐渐增加。GALTs在未成熟的初期，允许有2种显著对立作用：1）适度、恰当的针对病毒和细菌病原体的炎症反应调控免疫防御机制的发育；2）促进对食物抗原产生免疫耐受的极其复杂的免疫机制。在婴儿期的肠道菌群不断的、进行的构建和演替过程中，GALTs对这些复杂的肠道菌群产生耐受的同时，也有助于免疫系统诱导产生上述2种功能[3]。

二、肠道粘膜免疫系统的防御机制

肠道粘膜免疫系统是由免疫反应启动的有高度器官化场所和分散在固有层和肠上皮间的效应淋巴细胞等两部分组成的防御系统。外来的抗原物质，如细菌、病毒、食物中的大分子蛋白质等被摄入到GALT（如，PP结）和肠壁淋巴结内，这些高度器官化的二级淋巴器官结构是诱导肠特异性免疫的主要部位。被抗原激活的B细胞和T细胞从诱导场所通过淋巴引流管迁移到肠系膜淋巴结，然后进入血液循环，随着血流最后再归巢到粘膜效应部位。这些效应部位是由抗原特异性的T细胞和B细胞、分化的浆细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC）以及嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞等组成。总之，粘膜免疫系统的诱导部位和效应部位产生粘膜和血清抗体反应，T细胞介导免疫，局部免疫刺激或免疫抑制介质以及系统免疫无能（systemicanergy）[5,7]。

PP结位于肠粘膜下，是诱导肠特异性免疫的主要场所。在PP结圆顶区上分布有微皱褶细胞(microfoldcell，M细胞)。M细胞摄取和转运肠腔的抗原，如肠道病原菌、肠道原籍菌、病毒、食物中的抗原等到肠上皮下圆顶区，在此进行抗原处理和诱导特异性的免疫反应。圆顶区内有以B细胞为主的生发中心淋巴虑泡和以T细胞、巨噬细胞以及DC的滤泡间区。生发中心内含大量增殖淋巴母细胞,多数为IgA+细胞,另外含有以下包括TGF-β、IL-10以及由DCs释放的细胞信使和CD+CD40L+T细胞(促使同源的IgM细胞转换为IgA+细胞)。在滤泡间区的T细胞包括CD4+和CD8+T细胞,95%以上的T细胞表达αβTCR，而一小部分表达γδTCR，在PP结中50%～60%αβTCRT细胞是CD4+(辅助)T细胞,剩下的是CD8+(细胞毒/抑制)T细胞。

肠道黏膜免疫系统的防御机制是非常复杂的，除肠道的内环境非常复杂外,还需要依靠严格的调节机制来区分来自于肠道内环境中的危险信号和无害信号。在生物体的肠道黏膜免疫系统持续地受到包括病原体、食物蛋白和共生菌群在内的信号刺激,对于无害信号刺激,GALT或是保持一种低反应性的免疫监视状态,或是调动免疫耐受机制;而对于危险信号,GALTs则及时反应将其清除,从而维持肠道内环境的稳定[7]。

肠道内有大量的微生物定居,肠道生态系统的长期进化最终导致GALTs下调针对正常存在的共生菌群的固有炎症反应，有人把它称之为“生理性炎症”。GALT对共生菌的低反应性主要是由共生菌自身的特点、小肠上皮细胞(intestinalepithelialcell,IEC)表面的特性及肠道粘膜固有层（laminapropria,LP）内免疫细胞的特点等三个方面的因素所决定。1）.共生菌自身的特点：与致病菌不同,共生菌不能表达粘蛋白酶及黏附、定居和侵入因子,因此不能分解肠道内保护性的粘液层，小肠蠕动形成的粘液层流可以将共生菌冲离肠道表面,使其不能粘附IEC,破坏上皮屏障。2）.IEC表面缺少识别共生菌病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpattern,PAMP)的Toll样受体(Tolllikereceptor,TLR),如TLR2、TLR4、MD2和CD14[8],因此不能有效地识别共生菌的PAMP。研究发现,诱导活化细胞核受体过氧化物酶体增殖子活化受体γ(proliferator-activatedreceptor-γ,PPAR-γ)可抑制TLR诱导的NF-κB信号传导通路[9],从而抑制了炎症反应的发生。3）.LP内含有特殊的耐受性DC、巨噬细胞和调节性T细胞,这些免疫细胞可以产生许多抗炎症的细胞因子,从而下调针对共生菌的固有炎症反应,维持了肠道内环境的稳定[10]。

对于正常的食物蛋白,肠道黏膜免疫系统主要通过由调节性T细胞介导的主动抑制和抗原特异性T细胞克隆无反应或缺失(clonalanergyordeletion)等机制诱导的口服耐受来防止对食物蛋白的过敏反应[11]。

GALTs针对病原体引发的危险信号的反应起始于PP结、肠系膜淋巴结或小肠黏膜中的孤立淋巴滤泡[12]。病原体主要是通过M细胞进行摄取,并呈递到抗原呈递细胞(antigen-presentingcell,APC),APC继而将抗原呈递到黏膜内的淋巴细胞,活化的淋巴细胞在归巢受体的介导下到达效应组织。在效应位点处,抗原起始的免疫球蛋白A(IgA)B细胞分化成为IgA浆细胞,并向肠腔内分泌大量的抗原特异性的二聚化或多聚化的IgA,以捕获和清除腔内的抗原。另外,效应组织中还含有多种T细胞亚型,表现出辅助、调节和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)等活性,以完成和调节黏膜表面保护性的免疫反应。同时,黏膜组织摄取的抗原还可以进入淋巴循环,诱导全身性免疫反应的发生。对于小肠过量的共生菌，这种危险信号可以被隐窝内上皮细胞表面的TLR和NOD2/CARD15分子识别[9],继而引发固有免疫反应,诱导潘氏细胞(panethcell)分泌抗菌多肽,清除过量存在的微生物体。

三、宿主与肠道菌群相互作用的生理和病理的影响

通过对限菌动物的研究证明，肠道菌群对于宿主的器官结构、生理和免疫的发育有着极其重要的影响，其中包括IEC的功能和GALTs结构功能的影响。Backhed等发现无菌鼠体内脂肪增加60%，原因可能是独立过氧化物酶体增殖物活化激活受体α（peroxisomeproliferator-activatedreceptor-αindependent，独立PPAR-α）下调和诱发禁食脂肪细胞因子（fasting-inducedadipocytefactor，Fiaf）被抑制。肠道短连脂肪酸的多少于肠道细菌酶的活性有关。IEC的能量供给70%是靠丁酸氧化提供，同时，丁酸还是炎症因子NF-κB信使途径抑制剂。给无菌鼠接种多形类杆菌（Bacteroidesthetaiotaomicron），可以诱导有利于肠道粘膜屏障功能、营养物吸收、异型生物质（xenobiotic）代谢、分化、防御以及血管生成等一套基因的表达。肠上皮细胞对多形类杆菌的定植的反应有别于大肠杆菌或婴儿型双歧杆菌（Bifidobacteriuminfantis），这就支持了细菌在与宿主肠上皮细胞对话中存在着细菌特异性因子（bacteria-specificfactors）这个说法[13]。有证据表明，通过修饰肠上皮细胞的功能，肠道菌群和肠上皮细胞相互协助促成了肠道的微生态系统的建立。例如无菌鼠定植多形类杆菌可诱导宿主肠上皮细胞产生特异性的果糖结合糖;多形类杆菌还诱导基质金属蛋白酶裂解素（matrixmetalloproteasematrilysin）的表达，这种物质被认为是能激活肠粘膜抗微生物多肽或防御素前体的。将普通鼠肠道菌群接种到无菌鼠后，观察到无菌鼠的Paneth细胞RegIIIγ再生基因在mRNA和蛋白水平的表达[13]。RegIIIγ是具有抗菌特性的C型凝集素。脆弱类杆菌NCTC的细菌多糖通过MHCII的加工和呈现，触发了粘膜免疫系统的细胞免疫的生理成熟[14]。研究证实IBD病人RegIIIγ的表达增加，相反，CD病人的防御素水平下降。

普通鼠和无菌鼠的免疫反应有非常大的区别。的确，无菌鼠上皮内淋巴细胞的数量和细胞毒活性都是较低的，并且LP的淋巴细胞数量很少，有丝分裂的活性很低，PP结也很小，几乎没有发育。严重联合免疫缺陷（SCID）的鼠用成熟胸腺T细胞进行免疫重建，肠道粘膜淋巴细胞的数量与肠道原籍菌群关系很大。Mazmanian等证实脆弱类杆菌NCTC的细菌多糖通过MHCII的加工和呈现，触发了粘膜免疫系统的细胞免疫的生理成熟[15]。

数量巨大的肠道菌群、肠上皮细胞与粘膜的免疫细胞之间的相互作用是非常复杂的，最重要的先决条件是免疫功能和防御机制的成熟。为使肠道相关免疫系统的发育成熟，肠道菌群介导了由机体严格控制的一系列“炎症过程”，即所谓的“生理性炎症”[1]。生理性炎症有下列作用：1.短暂地激活免疫反应；2.免疫耐受的获得；3.肠上皮功能的改变；4.抗微生物的物质表达的增加；5.肠道能量平衡（增加丁酸盐和体内脂肪的含量）；6.促进PP结的发育；7.增加肠上皮间和固有层的淋巴细胞数量。对于遗传易感宿主而言，当环境刺激因素如病原菌感染或药物治疗，破坏了肠道上皮水平的微生态平衡，就可能会导致“生理性炎症”失控，以致发展成为“慢性炎症”[1]。例如IBD就是例证。这种慢性炎症有以下表现：1.肠腔微生物多样性的种属减少；2.粘膜细菌的密度增加；病原菌诱导的特异性的炎症反应；3.炎症反应的持续活动；4.调节机制的缺乏（如，PPARγ、TGF-β）;5.TLR表达增加以及NF-κβ被激活；6.炎症因子和粘附分子产出过多（如，IL-23、TNF、INF、ICAM-1）；7.抗微生物物质水平变化；8.过多地DC细胞被激活；9.益生菌和重组工程菌可以用于治疗这种慢性炎症。

四、益生菌对慢性炎症发展的防护作用

由于肠上皮的微生态环境遭到破坏，使得“生理性炎症”失控而发展成为“慢性炎症”。适当数量的益生菌有可能能预防和控制这种慢性炎症。研究发现结肠使用罗伊氏乳杆菌能增加小鼠的粘膜屏障功能和减缓结肠炎的发生，植物乳杆菌DSM（LactobacillusplantarumDSM）对氨甲蝶呤诱发的小鼠小肠结肠炎亦有相类似的保护作用。鼠李糖乳杆菌GGATCC通过激活Akt/蛋白激酶B信号途径，在IEC水平上可以抑制细胞因子引起的细胞凋亡。这些研究的结果支持益生菌帮助维护肠上皮的屏障功能，可能的机制之一是在肠粘膜炎症反应时肠屏障功能丧失。近期的研究发现，肠道的慢性炎症最可能的由于是肠上皮细胞的缺陷引起，而非淋巴细胞功能缺陷所致。用侵袭性大肠杆菌O29NM感染IEC后，内皮生长因子(EpidermalGrowthFactor，EGF)受体激活受阻，使用嗜酸乳杆菌ATCC和嗜热链球菌ATCC处理感染的IEC，EGF受体激活的功能恢复[16]。可以认为益生菌是通过增加IEC的紧密联结的蛋白表达和改善屏障功能而起作用。Gionchetti等用VSL#3（含有8种乳酸菌的复合制剂）治疗IBD患者，发现VSL#3能抑制肠粘膜的TNF和上调IL-10而阻止慢性结肠袋炎的复发[17]。还有很多学者对VSL#3进行了许多有益的研究：可以促使UC长期缓解；使得结肠功能、肠道屏障的完整性和肠组织病理学等恢复正常；通过抑制NF-κB减少热休克蛋白的表达以及阻断蛋白酶体功能等。

作用于肠道慢性炎症的益生菌不仅仅局限于乳酸菌类的细菌，例如大肠杆菌Nissle可以维持UC患者的缓解状态，其效果等同于马沙拉嗪。对右旋葡聚糖硫酸钠小鼠溃疡性结肠炎（DSS-inducedcolitis），大肠杆菌Nissle的正面作用是通过依赖TLR2和TLR4信使途径。有学者研究发现，在IEC培养基中，加入大肠杆菌Nissle通过诱导NF-κB信使瀑布效应，触发β-防御素的生成，增强了肠上皮的先天防御功能[18]。除了细菌外，真菌也对肠道慢性炎症有很好的作用，如布拉格酵母菌（Saccharomycesboulardii）作用于肠系膜淋巴结的T细胞，通过IFN-γ的累积从而抑制了慢性炎症[19]。甚至有研究认为布拉格酵母菌可以预防IBD的发生。重组工程菌的研究非常引人瞩目,例如乳酸乳球菌菌株（Lactococcuslactis）产生有细胞保护作用的三叶素或有免疫抑制作用的IL-10,是将来最具潜力的治疗IBD的药物。Braat等报道应用乳酸乳球菌在粘膜水平释放IL-10的一期临床试验结果，认为用于人类的IBD是可行的[20]。

本文转载于第六届全国儿科微生态学学术会议暨儿科微生态学新进展学习班资料汇编